科研没思路?跟我学习如何应用Xenium技术发高分文章!

今天小编和大家分享一篇2024年4月发表在Cell （IF=66.85）的文章" Cellular architecture of evolving neuroinflammatory lesions and multiple sclerosis pathology"。这篇文章通过原位测序（ISS、10x Xenium）技术，揭示了多发性硬化症 （MS）背后的复杂细胞动力学。



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研究背景

多发性硬化症 （MS） 是一种以多灶性病变和阴燃病变为特征的神经系统疾病。其主要症状包括活动能力和认知受损、疲劳、麻木、视力问题、抑郁和协调性差。在这种疾病中，主要体现由炎症、神经胶质增生、脱髓鞘和/或神经变性定义的损伤，影响中枢神经系统(CNS)的白质和灰质(WM和GM)。患者身体的免疫细胞攻击少突胶质细胞，而该细胞负责产生髓鞘，髓鞘包裹神经轴突的外壳，缺少髓鞘会导致神经细胞之间的信号无法正常快速传递，从而导致感觉减退和缺乏协调性等症状。尽管单细胞分析提供了对细胞病理学的见解，但对多发性硬化症背后的不断发展的细胞过程仍然知之甚少。

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分析方法

构建EAE小鼠模型以模拟脊髓病变，然后在不同阶段（症状前、症状初现、疾病高峰、晚期EAE）收集脊髓和大脑样本进行ISS原位测序；人颈部脊髓组织：两个对照(CTRL1和CTRL2)和四个进行性MS样本，带有病理学注释的活性(MSa1和MSa2)或非活性病变(MSi1和MSi2)，共6例样本进行266个基因的人类大脑Panel 的xenium原位基因表达检测。



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EAE的时空细胞图谱

首先作者构建EAE小鼠模型以模拟脊髓病变，然后在不同阶段（症状前、症状初现、疾病高峰、晚期EAE）收集脊髓和大脑样本。之后，通过原位测序分析239个基因。利用计算方法将空间数据与单细胞RNA测序数据相结合，识别细胞类型。应用分层聚类策略，有效避免偏差，精确描绘和量化细胞分布。

通过使用ISS，检测了592，421个细胞(270，878个来自脊髓，321，543个来自大脑)。在聚类之后，鉴定了41个独特的群体，包括23个主要的稳态和DA中枢神经系统驻留细胞和免疫细胞类型。在对照样本中，作者在空间上分辨了所有主要的中枢神经系统稳态群体，并发现有些独特的细胞亚群表现出对特定解剖区域的空间偏好，例如大脑和脊髓的GM和WM、皮质层、脑膜和背根神经节(DRG)等。



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炎症细胞环境的时间和跨区域图阐明了EAE的演变

作者对小鼠的脊髓在EAE不同阶段进行了免疫细胞浸润的定位和定量分析。结果显示，在疾病早期，免疫细胞开始在脊髓的WM空间增多，并在疾病高峰期扩散至整个脊髓实质。在EAE晚期，炎症部分消退，免疫浸润区域被神经胶质细胞填充。此外，尽管大脑通常不发展明显的病变，但在EAE峰值时，大脑内侧胼胝体和脑室附近区域观察到免疫细胞浸润，暗示炎症可能通过脑室和脑膜进入大脑。在疾病进展过程中，颈部区域的病变表现出异质性，可能反映了急性炎症和慢性化病变之间的状态。MS的不同临床亚型在脊髓病变分布上也存在差异，其中背侧柱常受累，而原发性和继发性进展型MS患者更易在外侧束出现病变。EAE模型中的免疫细胞浸润倾向于影响脊髓的特定区域，这些区域在疾病高峰和晚期炎症解决效率较低，可能导致病变的慢性化。

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细胞组成驱动的病理区域识别

细胞组成驱动的跨区域和疾病时间点病理区室的鉴定通常通过核密度的增加、小胶质细胞的富集、巨噬细胞的免疫染色和髓磷脂的损失来评估。这里作者针对不同炎症环境形成的综合细胞景观来分析EAE病理，通过邻域分析对23种主要细胞类型进行分析，并检查了它们在中枢神经系统中的分布。这种方法类似于利用空间数据来识别神经解剖区室。研究中定义了五个不同的病理区室，这些区室标志着EAE病变从早期到复杂和解决的各个阶段。无症状小鼠虽受免疫浸润影响，但未定义任何病理区室。而早期症状和高峰EAE小鼠的脊髓显示出三个独特的病理区室，与EAE晚期的区室不同。此外，还识别出响应于EAE脑中免疫浸润的特定胼胝体病理区室。并且发现胶质细胞和血管细胞是脑免疫浸润室（bIIC）的标志。



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EAE病变以离心方式传播

通过研究EAE感染脊髓内病理区室的细胞组成。作者发现在峰值EAE的腰椎样本中，病变显示出最复杂的结构，包括三个独特的部分，其认为这些病变已经完全发展，并以此为基础将这些区域分为(1)病变核心区域(LCC)，(2)“病变边缘”区域(LRC)，和(3)“病变周围”区域(PLC)。并且通过分析发现复杂病变（病变III期）多见于腰椎EAE脊髓峰值，而轻度EAE及颅脑区病变较简单，分病变I期（PLC）和病变II期（LRC+PLC）。数据显示，PLC在轻中度炎症时独立出现（病变I期），随炎症加剧向LRC及LCC过渡。



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DA-神经胶质标记全局、损伤独立病理学

作者发现DA-神经胶质细胞不仅是病理标志，也促进GM与WM变化，并且发现DA-神经胶质细胞的转录谱随时间和跨病理区室而变化，这表明不同条件下DA-神经胶质细胞生物学过程的差异。



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人类颈脊髓的空间细胞图阐明了活动期和非活动期MS病变的细胞病理学

作者将ISS与Xenium原位平台应用于6个人类死后颈椎脊髓横截面样本--两个对照(CTRL1和CTRL2)和四个进行性MS样本，带有病理学注释的活性(MSa1和MSa2)或非活性病变(MSi1和MSi2)。使用了包含266个基因的Xenium人脑基因Panel，针对与生理和病理条件相关的细胞类型和状态 ，共鉴定了 660,801 个细胞（MS 中为 465,294 个，对照中为 195,507 个），平均表达145±104个转录本和47±18个基因。鉴定了27个细胞群，包括主要稳态和疾病相关胶质细胞（OLGs；Astros）、髓系细胞（MP/MiGl、巨噬细胞和小胶质细胞）、血管细胞和血管巨噬细胞（vascular_MP）、室管膜细胞、内皮细胞（Endo）、T细胞、雪旺细胞和神经元。并且发现了多种细胞类型表现出预期的空间偏好。人脊髓样本中还鉴定了WM或GM富集的特异性Astro和少突胶质细胞群体。这些说明了GM-和WM-特异性环境线索诱导不同的人类塑型状态，或者这些区域内的神经元需要特定的少突胶质细胞支持。



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将活动期人类多发性硬化病变解卷积为新的亚区室揭示了WM病理学中的GM少突胶质细胞

作者使用27个细胞群来绘制已知的解剖结构及病理区室，包括中央管（CCa）、背根神经节（DRG）、灰质（GM）和白质（WM），以及与血管和脑膜结构对齐的区域。在MS样本MSa1和MSa2中，观察到不同病变区域的细胞组成差异显著。MSa2中病变2.2富含血管细胞、非DA-Astros和MP/MiGl_2，而GM和WM的变化未通过免疫组织学鉴定。样品 MSa1 在整个过程中都发生了变化，GM病理区室中MP/MiGl_2和OLG_GM比例较高，且显示分散的WM病变和血管受影响区室，T细胞增多。特别地，MSa1中的ac_WM_lesion_A病变由多种髓样细胞、星状细胞和少突胶质细胞组成，其中MP/MiGl_1表达反应性小胶质细胞标志物，而MP/MiGl_2表达更高水平的CX3CR1、GPR34、ITGAX和FCGR1A。通过比较两个活性样本的健康和受MS影响的WM时，发现OLG_GMs在几个受疾病影响的区域内更丰富。这些数据可能表明，GM少突胶质细胞的突出作用。



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DA-胶质细胞在人类MS脊髓中的分布类似于它们在小鼠EAE模型中的分布

研究MS背景下的DA型星形胶质细胞（DA-Astro）和少突胶质细胞状态。基于基因表达，作者将星形胶质细胞细分为稳态型、中间型和DA型。中间型星形胶质细胞表达较低水平的SERPINA3，并且不完全表达DA型星形胶质细胞的标记物，包括HILPDA。稳态型星形胶质细胞在对照组中占主导地位，但在活动性病变中进一步富集。在MSa1中，中间型星形胶质细胞广泛分布，而在非活动样本中，则富含DA型星形胶质细胞，这可能是由于星形胶质细胞增生所致。因此，人类 Astros 可能会在局部获得 DA 转录谱，并且独立于 MS 病理学。随着MS的发展和进展，它们最终会变得广泛，在活动性病灶中和在非活动性病灶中进一步丰富。这些分布与 SERPINA3表达相关，因此可以将其作为人类和小鼠MS病理学的标志物引入。

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总 结

作者通过对小鼠EAE中疾病进展的时间和区域速率进行建模来研究 MS 的细胞动力学。通过使用ISS进行单细胞空间表达谱分析，作者注释了疾病邻域并发现了活动病变的离心进化。通过使用Xenium技术对人类MS脊髓样本进行研究，确认了DA-glia在人类MS脊髓中的分布类与小鼠EAE模型中的状态及其分布相似。本研究通过建立单细胞空间分辨率的小鼠和人类MS神经病理学的空间图谱，揭示了MS背后的复杂细胞动力学。

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END

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