常见光合作用测量仪器及技术要点

本文会用到一些仪器图片，但不涉及任何品牌和型号推荐。对于很多植物学，农学，园艺，林学的同学来说，提到测量光合作用的仪器设备，可能很多人都知道光合仪和荧光仪。因为无论您是做栽培的，还是做育种的，抑或您是做生态或资源与环境的，再或者您是做基因编辑技术开发研究的，只要涉及评估植物生理状态，光合似乎是一个躲不开的测量内容。毕竟，作为自养的初级生产者，植物进行光合作用的能力最能代表它在所处环境下的生长状态。光合作用是植物最重要的生物化学反应之一，是作物产量形成的主要能量来源和物质基础。

DOI: 10.1038/s41586-019-1679-0

光合作用的测量很重要，也很普遍，那么问题来了，当我们测量植物的光合作用时，具体是在测什么？我们常说的光合速率是如何测量与评估的？光合仪和荧光仪都可以测量光合作用，如何选择？哪个更好？希望您看完本文后能有所收获。
一、光合作用的光&合

光合作用的英文单词Photosynthesis可以拆解为Photon（光子）+Synthesis（合成）。因此从字面意义上理解光合作用过程可以分为以光能利用为基础的反应和以固定CO2合成有机物为基础的反应。在经典的植物生理学上，光合作用也常被分为光反应和碳固定（碳反应）两个小节讲解。下面两句话是对光反应和碳固定反应的简单概括。



DOI: 10.6084/m9.figshare.24039480
光反应：发生叶绿体的类囊体膜上，以光能捕获传递转化为基础的光能利用，氧气释放和电子传递过程。

碳固定：发生在叶绿体基质内，以CO2吸收同化合成为基础的酶促反应，由Rubisco催化完成RuBP羧化，还原，再生等过程。

> 总结 <

光反应：反应相对快，光子转化成电子实现太阳能的初步利用。涉及到光能转换效率，激发能耗散途径，电子传递速率，NADPH和ATP合成。


DOI: 10.6084/m9.figshare.24045549
暗反应：反应相对慢，吸收CO2，通过酶促反应利用光反应产生的NADPH和ATP，合成糖类，淀粉，实现活跃化学能到稳定化学能的转化。涉及气孔导度，叶肉导度，蒸腾速率，羧化效率。



DOI: 10.6084/m9.figshare.14794281

二、测量光反应和碳固定的常用仪器

光合仪：气体交换原理，利用红外气体分析器（InfraRed Gas Analyzer IRGA）测量流经叶片前后CO2和H2O的浓度变化，分析叶片与环境发生的气体交换，用固定了多少 CO2来表征光合作用的能力。常用的参数是净光合速率，蒸腾速率，气孔导度，胞间二氧化碳浓度等。气体交换是非常经典的光合作用测量方法，光合仪是常被用来测量气体交换的仪器。光合仪的生产厂家有很多，（此处省略若干字），感兴趣的老师可以找小编咨询他们的优缺点。

荧光仪：叶绿素荧光原理，通过检测光合作用光能利用过程中叶绿素荧光的产量(F)，来分析光合作用光能吸收，转化和分配。用叶绿素荧光参数来表征不同途径能量分配的多少。常用的参数有光系统的最大光能转换效率(Fv/Fm), 实际光能转换效率(Yield), 光化学淬灭(qP), 非光化学淬灭(NPQ), 电子传递速率（ETR）等。叶绿素荧光法具有无损，原位测量等优势，可以作为光合作用的探针，叶绿素荧光仪广泛应用于实验室和野外光合作用研究。 荧光仪的生产厂家也有很多，（此处省略若干字），感兴趣的老师可以找小编咨询他们的优缺点。



> 总结 <

光合作用和蒸腾作用相伴发生，光合仪测量叶片和环境的气体交换。实际被测量的交换气体是 H2O和 CO2，交换的门户是气孔，交换的结果是水分从叶片中蒸腾散失，CO2进入叶片被同化。光合仪测量光合作用极易受到环境湿度，CO2浓度，光照，温度的影响，测量过程中应尽量保持环境条件稳定。



video: https://mp.weixin.qq.com/mp/readtemplate?t=pages/video_player_tmpl&action=mpvideo&auto=0&vid=wxv_1537957420440846340

光能的吸收与耗散平衡，荧光仪测量吸收光能中用于发射荧光的部分，根据模型计算转化为光合电子传递和热耗散的部分。荧光仪测量的叶绿素荧光通常指的是室温(25℃)叶绿素荧光，荧光仪测量光合作用主要受光照强度(PAR)和温度的影响，也受CO2和水的影响，但是影响相对较小。


DOI: 10.1002/9780470015902.a0029372
三、 如何选择或哪个更好用？

任何一种仪器的选择，都要服从研究内容对工具的需求！针对具体的应用目的和场景以及研究对象和内容才能来选择合适的光合作用测量仪器。如果您是在改造光系统的天线结构，荧光仪似乎更适合；如果您重点关注光呼吸支路构建，那就应该选择光合仪。如果您要测量池塘水里的藻类及其光合活性，浮游植物分类荧光仪是一个不错的选择。倘若您心向大海，关注海洋中珊瑚的光合作用活性，在您学会潜水的前提下，挑选一款可以到水下使用的荧光仪就成了不二之选。下面两个简单例子可以帮助您直观的了解他们的应用领域。

一个种质资源管理中心要想要快速评估200个水稻品种的田间光合特性差异，筛选光能利用效率高的株系，可以尝试使用荧光仪测量实际光能转化效率即可，荧光仪可以在短时间内测量大量样品。



换个角度，如果要评估改良的新品种和亲本之间的光合差异，建议使用光合仪测量，毕竟固定更多CO2生成糖和淀粉才是作物产量提升更好的证据。



光合仪和荧光仪可以独立存在，但是光反应和碳固定不是独立运行。所以，两者没有绝对意义的高下，因为光反应和暗反应同样重要。如果想全面分析光合作用，光合仪和荧光仪都需要用到，最佳的方案是联用，同步测量气体交换和叶绿素荧光。



四、使用光合仪和荧光仪要注意什么？

> 光合仪 <
1、预热！预热！预热！所有IRGA原理的光合仪都需要预热！不同品牌的光合仪预热时间不同，实际应用中预热的时间约为30-60分钟。 2、分析器调零，调零的目的是为了消除光合仪的检测误差。不同品牌，不同型号的光合仪，根据IRGA类型的不同，调零模式有差异。目前比较常见的是双通道四分析器光合仪，双通道是Reference 和 Sample 两股气路通道，四分析器分别是H2O Reference分析器和CO2 Reference 分析器，H2O Sample分析器和CO2 Sample 分析器。在测量叶片前先测量分析器的读数差异并将其固定即视为调零，之后才可以进行气体交换的测量。

3、精确控制环境因子（光、温、水、气），光合仪主要采用开放式气路系统，即光合仪从环境中吸取空气，测量流经叶片前后 CO2 和 H2O 的浓度变化，测量后的气体从出气口流走。环境空气的温度，湿度，CO2 浓度及环境的光强剧烈波动会严重影响光合仪的使用。因此建议在使用过程中精确控制环境因子。


4、原位测量，严禁离体，因为离体叶片生理状态会发生变化，最明显的就是气孔关闭。除了离体损伤之外，可能会导致气孔关闭的还有手上的汗液或化妆品残留等，所以不要直接用手擦拭叶片。

5、叶片面积（或重量），光合仪计算的光合速率是单位面积（或重量），单位时间内的CO2 同化率，测量时需要已知的测量面积（或重量）。现在有些品牌的光合仪允许测量完成后修正测量面积（或重量），重新计算光合速率。


6、叶片温度，叶片温度是计算光合参数和控制气体交换温度的重要依据。因为光合仪的测量原理默认叶肉细胞内为 100% 相对湿度。 7、叶室气流流速，流经叶室的气流流速，与气体交换参数计算有关。光合能力弱的阴生植物可以尝试低流速测量。
8、日常维护，光合仪属于精密的气体分析仪器，为保证测量的准确性，应该定时做标定，标定程序分为 CO2 和 H2O 分析器零点标定和 CO2 和 H2O 分析器跨度标定。光合仪在环境因子控制过程中会消耗一些药品，如干燥剂和碱石灰等，使用前后要注意检查。光合仪作为野外便携式测量设备，时常会被带到野外去实验，使用中务必留意电池电量状况，及时保存数据，使用前后及时给电池充电。特别提醒，远离水源！

> 荧光仪 <

1、荧光仪的种类，目前常用的叶绿素荧光仪有两种，脉冲调制式的和连续激发式的。脉冲调制式的可以在有环境光为背景的情况下使用，连续激发式的不可以。但是连续激发式的时间分辨率比脉冲调制式的高。脉冲调制式的叶绿素荧光仪通常用来测量淬灭分析，快速光曲线等。连续激发式的通常用来做快相分析。



不同叶绿素荧光技术探测不同光合生理过程

DOI 10.1007/s11120-014-0024-6

2、暗适应，为了更好的对叶绿素荧光测量进行合理的解释，如何定义光合机构在测量开始时的状态非常重要。所以，在大多数实验中，无论脉冲调制式还是连续激发式叶绿素荧光仪，测量前一般需要首先进行暗适应。叶片的暗适应状态是光合机构的基本状态。暗适应的方式有很多种，整株植物置于暗室，单个叶片放入暗适应夹，夜间测量。暗适应的时间长短取决于我们希望从叶绿素荧光中得到什么信息。例如，大田作物叶片光合能力评价，暗适应时间一般只需要 30 分钟。而实验室内拟南芥叶片跨膜质子梯度ΔpH 的测量则需要几个小时甚至更长。



3、荧光仪光源，在荧光参数测量前对荧光仪光源有明确的认识是非常有必要的。以调制式的叶绿素荧光仪为例，通常会配置四种光，测量光 ML，光化光 AL，饱和脉冲光 SP，远红光 FR。

测量光(Measure Light，ML)，根据植物对光的吸收特性，荧光仪目前常用的光源有两种，蓝光和红光。更宽的荧光检测范围使蓝光版比红光版更灵敏，因为在叶绿素含量高的样品中，短波长荧光会被叶绿素重新吸收，而蓝光版恰恰可以检测到短波荧光。因此，测量这样的样品时，蓝光版的灵敏度略好于红光版。红光版可用于研究附着蓝藻。而蓝藻在蓝光区的吸收能力往往很差。因此，在蓝藻的研究中，红光版通常要比蓝色版更受欢迎，因为红光版对蓝藻表现出更高的信噪比。
测量光光强一般比较弱(＜1μmolm-2s-1)，具有调制频率，用于信号检测，测量前需要调整测量光强度(Int.)和频率(Freq.)使荧光信号达到基本检测要求。测量光强度过高， 过早激发光合作用，导致部分反应中提前关闭，饱和脉冲激发可变荧光Fv会被低估，最大荧光Fm可能会因为过饱和被低估。如果测量光强度太低，则无法在测量开始时将本底荧光激发出出来，导致饱和脉冲激发可变荧光Fv会被高估。

光化光(Actinic Light AL)，是诱导植物发生光合作用的光，又叫作用光。常见的荧光仪光化光光源有两种， 460nm左右的蓝光或 630nm 左右的红光。光化光的强度通常也是可以调节的，以适应不同的实验需求。但是请注意，光源出口与样品的距离和角度变化会改变样品表面的光强。所以测量前务必明确到达样品表面的光强具体是多少。很多设备的出厂设置都是预设的，安装调试时最好执行光强校准，确保软件或者报告里的 PAR 值与样品水平的实际光强值一致。



饱和脉冲(Saturation Pulse，SP)，脉冲调制式荧光仪除了上述两种光还有一种饱和脉冲光，而连续激发式荧光仪通常只有饱和脉冲光。饱和脉冲在荧光仪中通常是用来计算数据的，光强比较强，一般都要大于3000μmolm-2s-1。为适应不同样品类型和实验要求，饱和脉冲的强度和持续时间通常也是可以调节的。

远红光(Far Red Light FR)，有些品牌或型号的荧光仪还会搭载用于激发光系统 I 的远红光，远红光可以用来测量 Fo’，暗弛豫，状态转换。
4、Fv/Fm, (Fm-Fo)/Fm, 最大光能转换效率，反映植物潜在的最大光合能力。通过测量暗适应之后的最小荧光 Fo 和最大荧光 Fm 计算而来。该参数相对独立，可以单独使用，来评估胁迫条件下植物的光合特性变化或用来筛选突变体。大多数荧光仪都可以测。 5、ΦPSII，(Fm’-F)/Fm’, 实际光能转换效率，反应植物在稳态下的实际光合能力，通过测量稳定环境（光温水汽）状态下的最小荧光 F 和最大荧光 Fm’计算而来。可以在晴朗的天气，快速测量大量植物的光合特性。测量过程要同时采集环境参数，如光强，温度等。 6、诱导曲线(Induction Curve IC)，慢速荧光诱导动力学(Slow Kinetics)的一种。测量诱导曲线可以获得淬灭分析(Quenching Analysis)的参数，光化学淬灭(qP), 非光化学淬灭(NPQ)。实际应用中，诱导曲线后可以增加暗弛豫的测量，进一步分析植物非光化学淬灭的能力。完整操作如下，暗适应的样品，先测量FoFm，然后通过光化光诱导植物叶片达到稳态，测量光化学淬灭和非光化学淬灭。最后关闭光化光，打开远红光，继续测量，直到植物在暗处再次达到稳态，测量暗稳态下的荧光淬灭。谨记，诱导曲线的测量需要暗适应。 诱导曲线的另一个核心技术要点是植物在诱导的光强下达到稳态，通常需要几分钟到十几分钟的时间。未达到稳态的诱导曲线测量的淬灭参数不可用。


7、光曲线(Light Curve LC)，测量不同光强下的量子产率，计算电子传递速率 ETR

（ETR=PAR*Yield*吸光系数*0.5）。光曲线是光响应曲线的一种表征方式，相对于光合仪测气体交换的 A/Q 曲线，荧光仪测量 light Curve 的时间可以短得多，所以又被称为快速光曲线(RLC)。光曲线可以拟合得到光能利用效率 α，最大电子传递速率 ETRmax，半饱和光强 Ik，实现不同样品光合特性的对比。



8、荧光成像，普通的荧光仪通常以数据报告的形式呈现测量结果，而荧光成像则可以将数据图像化，直观的展现样品间的光合特性差异，极大地扩展了叶绿素荧光技术的应用。如今，荧光成像早已经成为光合生理研究，遗传育种，突变体筛选，病虫害早期检测的常用工具。相比于普通的荧光仪，荧光成像的测量面积大，全叶片成像有助于分析叶片的横向异质性。荧光成像并不是面积越大越好，比面积更重要的是成像区域光场的均一性。均匀的广场保证了叶片每一个部位的照光条件一致，实验结果才更可靠。所以荧光成像的光源布局要经过精心的的设计，就像手术台的无影灯，照亮每一个看得见的角落。 更多荧光成像的技术要求可以参考之前的技术文章IMAGING-PAM没那么简单！！！



最后总结一下，研究光合作用的仪器设备还有很多。从单细胞尺度到生态系统尺度，不同的设备服务不同的研究内容，小编后续找机会再盘点。另外，光合作用研究仪器没有好坏之分，但是考虑到掌握的难易程度，可能会有好用与不好用之别。小编认为更重要的是熟悉仪器的原理，这样才能更好的判断测量结果是否有效，DIY 或 Custom-Made 的测量系统照样可以发好文章。正所谓光合仪器测量的数据千篇一律，有趣的 idea 万里挑一。
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